中心实验室

一、原理

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis, RIF）是各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径和主要病理基础。

目前认为，肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞 (Myofibroblast, Myof) 是肾间质纤维化形成的重要机制之一。Myof是间质中合成细胞外基质的主要细胞，而细胞外基质的增多直接导致了肾脏纤维化的进行性发展。Myof 的来源还不完全明确，近年研究发现，有相当一部分来源于肾小管上皮细胞，有学者报告，在肾纤维化的发生过程中，36 %的新增纤维细胞来源于肾小管上皮细胞转分化（细胞表型的转化），转分化的特点是肾小管上皮细胞发生了形态、表型和功能的改变，首先肾小管上皮细胞之间的粘附消失，然后表达肌成纤维细胞的标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），而上皮细胞的标志性蛋白E-钙粘蛋白（E-cadherin）几乎不表达，随着小管基底膜结构的破坏，细胞获得了移行及浸润的能力，到达间质作用部位分泌基质蛋白，导致纤维化形成。

大量文献证实,TGF-β₁ 是最重要的促肾纤维化细胞因子，它在多种慢性肾病中大量表达和分泌。研究表明，TGF-β₁在2～10 ng/mL浓度时能诱导体外培养的肾小管上皮细胞增殖，引起肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转化，并通过受体信号转导合成胶原蛋白、纤连蛋白（FN）、层粘蛋白（LN）等细胞外基质成分（ECM），引起ECM过度沉积，同时抑制ECM降解酶的表达，进而抑制ECM降解，从而导致纤维化的发生发展。目前，许多研究已将TGF-β作为研究肾小管上皮细胞向成纤维细胞转分化的经典诱导因子。

本模型采用TGF-β₁10 ng/mL浓度诱导体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化来构建肾间质纤维化细胞模型。

二、应用范围

本模型可用于中医药防治各种肾脏疾病的应用基础研究。

三、模型构建方法

1 材料

1.1 细胞株  人肾小管上皮细胞（HK-2）。

1.2 药品及试剂

DMEM/F12（1:1）细胞培养基，Gibco公司生产；胎牛血清，Hyclon公司生产；EDTA、胰蛋白酶，Amresco公司生产；鼠抗人α-SMA多克隆抗体，abcam公司生产；兔抗人E-cadherin多克隆抗体，Cell Signaling（CST）公司生产。

人重组TGF-β₁，购自R&D System公司，根据说明书，用含1 mg / mL牛血清白蛋白的无菌弱HCL（4 mM）配制为1μg / mL的储存液，无菌EP管﹣70℃储存，用时配成10 ng/mL浓度。

1.3 仪器

二氧化碳培养箱，超净生物安全柜；倒置显微镜等。

2 细胞培养及分组

HK-2 细胞用含 10 % 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素 DMEM/F12（1:1）完全培养基，于 37 ℃、5% CO₂ 细胞培养箱中培养。每隔 2-3 天换新鲜培养基一次，培养融合至 80 % 以上，用含 0.25 % 胰蛋白酶、0.05% EDTA 的消化液消化，用完全培养基终止消化后，离心 5 min（1000 r / min）。用新鲜培养基将细胞重悬后进行传代培养。实验前先用无血清培养基培养24 h使细胞同步化，实验重复3次。

传代培养的HK-2 细胞分为以下2 组：（1）空白对照组：DMEM/F12 培养液；（2）单纯TGF-β诱导组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β₁。

3 检测指标：α-SMA、E-cadherin

免疫组化法检测结果显示：正常细胞呈卵圆形或近立方形铺路石样，细胞成片生长，胞间连接紧密，胞膜强烈表达E-cadherin，几乎没有α-SMA表达；经TGF-β₁诱导后细胞形态出现明显改变，大量细胞拉长为梭形，细胞出现间隙，似成纤维细胞状生长，胞浆强烈表达α-SMA，E-cadherin表达几乎消失。见图1、2、3。

             A：空白对照组          B：单纯TGF-β₁诱导组

图1  HK-2细胞形态（20X）

A：空白对照组      B：单纯TGF-β₁诱导组

图2   α-SMA的表达（20X）

A：空白对照组      B：单纯TGF-β₁诱导组

     图3  E-cadherin的表达（20X）

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